近日，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院與澳門大學(xué)合作在Cell Reports在線發(fā)表題為Vibrio parahaemolyticus prey targeting requires autoproteolysis-triggered dimerization of the type VI secretion system effector RhsP的研究論文。研究發(fā)現(xiàn)，腸炎弧菌效應(yīng)蛋白RhsP形成一個桶狀結(jié)構(gòu)，通過自水解引發(fā)桶內(nèi)VIR（VgrG2-interacting region）肽段明顯的構(gòu)象變化，并進(jìn)一步證明這一構(gòu)象變化促進(jìn)了RhsP二聚體的形成，釋放核酸酶毒素，提示RhsP以自水解發(fā)生構(gòu)象變化進(jìn)而促進(jìn)二聚體形成來靶向獵物細(xì)胞這一分子機(jī)制，為潛在新型抗感染手段的開發(fā)提供了分子機(jī)制和理論基礎(chǔ)。

　　細(xì)菌Ⅵ型分泌系統(tǒng)（Type VI secretion system, T6SS）廣泛存在于革蘭氏陰性菌中，其構(gòu)造類似于噬菌體尾管，主要通過掛載并分泌不同的毒素效應(yīng)蛋白來攻擊獵物細(xì)胞并取得菌群競爭優(yōu)勢。其中Rhs家族蛋白是一類大型效應(yīng)蛋白,通過其C端的核酸酶毒素切割獵物細(xì)胞DNA以達(dá)到殺死獵物的目的。同時，在毒素效應(yīng)蛋白基因組的下游通常伴隨可以中和其毒性的免疫因子的表達(dá)，這也使得攜帶Rhs毒素的細(xì)菌能夠保護(hù)自身不受影響。T6SS如何分泌Rhs這樣的大型效應(yīng)蛋白的分子機(jī)制一直是領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，而Rhs家族效應(yīng)蛋白如何釋放核酸酶毒素這一過程也未得到明確的解析。

　　本研究首先在致病性腸炎弧菌中發(fā)現(xiàn)了一個能夠自水解的T6SS效應(yīng)蛋白RhsP，進(jìn)一步通過生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RhsP自水解為三個片段，N端、 Rhs桶和具有核酸酶毒性的C端（圖1A）。為了解答自水解這一過程對RhsP的分泌和核酸酶毒素釋放的作用，團(tuán)隊(duì)利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了RhsP自水解后(cleaved RhsP)和RhsP自水解前（Uncleaved RhsP）的高分辨結(jié)構(gòu)(圖1B)。對自水解前后的RhsP的高分辨結(jié)構(gòu)分析后發(fā)現(xiàn)，Rhs區(qū)域形成了一個封閉的桶狀結(jié)構(gòu)。N端肽段從桶蓋頂部縫隙延伸出去，提示N端水解后的離開軌跡（圖2A）。另外，發(fā)生水解后的VIR在構(gòu)象上發(fā)生了巨大變化，它以U形在桶內(nèi)伸展并將含有核酸酶毒素的VIR-C端送出到桶蓋上移引起的缺口處（圖2B）。最后，通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)VIR結(jié)合β-sheet的疏水內(nèi)表面，通過構(gòu)建VIR-C端F1208A/Y1209A突變株驗(yàn)證了RhsP自水解后引發(fā)VIR構(gòu)象變化促進(jìn)二聚體的形成。

　　本研究通過生化實(shí)驗(yàn)和冷凍電鏡等手段，捕捉了效應(yīng)蛋白自水解前后瞬間的構(gòu)象變化，發(fā)現(xiàn)RhsP的自水解過程引發(fā)了Rhs桶狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，揭示了釋放核酸酶毒素的分子機(jī)制，同時也發(fā)現(xiàn)了VIR區(qū)域構(gòu)象變化促進(jìn)的RhsP二聚體形成,是其靶向獵物細(xì)胞的關(guān)鍵步驟（圖3）。

　　澳門大學(xué)博士后唐樂、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院博士生董淑琦、澳門大學(xué)博士后Nadia Rasheed和博士生胡巧穎、生物島實(shí)驗(yàn)室科研助理周寧坤為本文共同第一作者。澳門大學(xué)William Chong Hang Chao教授、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院何俊研究員和澳門大學(xué)鄭軍教授為本文的共同通訊作者。該研究得到了澳門大學(xué)、澳門特別行政區(qū)科學(xué)技術(shù)發(fā)展基金以及國家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金等的資助。

論文鏈接

圖1 A: 毒素效應(yīng)蛋白RhsP結(jié)構(gòu)域示意圖，B: RhsP自水解前后高分辨蛋白結(jié)構(gòu)圖

圖2 A: RhsP自水解前后N端肽段軌跡圖，B: RhsP自水解前后VIR構(gòu)象變化圖

圖3 RhsP自水解引發(fā)的二聚體形成并靶向獵物細(xì)胞的步驟模型