單堿基編器是近年才出現(xiàn)的新基因編輯系統(tǒng),被認(rèn)為是基因編輯技術(shù)3.0版本。該系統(tǒng)的基本原理是基于脫氨酶的作用,將胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?T)(Cytidine base editors, CBEs),或?qū)⑾汆堰?A)轉(zhuǎn)變成鳥嘌呤(G)(adenine base editors, ABEs),這種堿基間的相互轉(zhuǎn)換,不會(huì)引起雙鏈 DNA 的斷裂,利用其進(jìn)行基因編輯,更加有效而又安全。而較早期的Cas9等基因編輯工具均會(huì)伴隨DNA斷裂,后者會(huì)造成基因組的不穩(wěn)定性,對(duì)被編輯的生物機(jī)體帶來安全隱患。

　　單堿基編輯器出現(xiàn)以后,很快被廣泛地運(yùn)用于動(dòng)物、植物和人細(xì)胞的基因編輯。但是,以往的研究主要集中在單位點(diǎn)的堿基突變。而人類遺傳性疾病以及動(dòng)物遺傳性狀改變往往涉及到多個(gè)位點(diǎn)的單堿基突變,因此,對(duì)基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單堿基編輯才更有可能培育出能夠模擬人遺傳性疾病的大動(dòng)物模型和擁有優(yōu)良遺傳性狀的畜禽新品系。

　　該研究利用BE3和A3A-BE3兩種單堿基編輯工具,在細(xì)胞和胚胎層面,對(duì)基因組進(jìn)行三基因單堿基編輯,每個(gè)基因設(shè)計(jì)一條gRNA,突變成終止密碼子或者突變誘導(dǎo)新的mRNA剪切位點(diǎn)。在胎胚上,三基因同時(shí)被編輯效率最高可達(dá)50%。而細(xì)胞層面,三基因同時(shí)編輯最高可達(dá)25%。在很多動(dòng)物體內(nèi)存在有內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,這種基因系列相同的內(nèi)源性病毒往往以多拷貝的形式分布于染色體的不同位點(diǎn)。而豬內(nèi)源性病毒的存在,給豬作為異種移植器官供體帶來安全隱患。本研究還對(duì)與豬內(nèi)源性病毒復(fù)制有關(guān)的pol基因進(jìn)行了單堿基突變,制造提前的終止密碼子,從而實(shí)現(xiàn)單基因的多位點(diǎn)失活。通過二代測(cè)序分析,可以看到在體細(xì)胞內(nèi),多拷貝的敲除率達(dá)到80%以上,而在胚胎層面,71%病毒拷貝得到敲除。因此,本研究證明,單堿基編輯系統(tǒng)在細(xì)胞和胚胎水均可實(shí)現(xiàn)多基因或單基因多位點(diǎn)的高效堿基突變。

　　本研究進(jìn)一步通過胚胎注射以及體細(xì)胞核克隆的途徑分別培育出了單基因突變豬和多基因突變豬。所獲得含有單基因突變的杜氏肌肉營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy, DMD)豬模型以及早衰癥(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HGPS)豬模型,均極好地模擬了病人的表型。所獲得的與免疫細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的三基因(RAG1、RAG2、IL2RG)純合突變豬的胸腺和脾臟發(fā)育有明顯缺陷,T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞缺失,免疫細(xì)胞不能進(jìn)行V(D)J基因組重排,具有典型的重癥免疫缺陷表型。由于豬的免疫系統(tǒng)與人非常相似,這種重癥免疫缺陷豬模型將成為生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要基因修飾工具豬。

　　該論文的共同通訊作者為賴良學(xué)研究員以及王可品副研究員。廣州生物醫(yī)藥與健康研究院博士研究生謝精科、葛維凱、栗楠、劉琪帥為共同第一作者。研究工作得到中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略先導(dǎo)專項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省實(shí)驗(yàn)室、廣東省及廣州市科技計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)等項(xiàng)目的支持。