7月28日，克隆犬“龍龍”出生滿兩個月了?！褒堼垺币怀錾筒缓唵?，因為它是中國首例完全自主培育的體細胞克隆犬，更是世界首例基因編輯克隆犬。該成果由生物院賴良學研究員帶領(lǐng)希諾谷公司科研團隊及廣州生物院實驗室團隊完成。6月底，公安部南昌警犬基地將“龍龍”的血液樣本，與另一只比格犬“蘋果”進行DNA檢測發(fā)現(xiàn)，“龍龍”與“蘋果”同一認定幾率大于99.99%，但排除與代孕母犬親子關(guān)系。同時，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院（簡稱生物院）賴良學研究員團隊，對“龍龍”與“蘋果”APOE基因進行鑒定發(fā)現(xiàn)，其基因敲除方式也完全一致。

　　“蘋果”耳朵上被取下極小塊的皮膚組織

　　2016年底，世界首例動脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋果”，在北京希諾谷公司誕生，它的名字源于A POE基因的諧音。研究團隊的主要青年技術(shù)骨干王曉民介紹，“蘋果”出生后，研究人員從其耳朵上取下極小塊的皮膚組織，通過細胞體外培養(yǎng)，保存在液氮罐中，留待后續(xù)發(fā)力?！叭魏沃参锘騽游锏囊粋€細胞，都包含了整個生物體的遺傳信息，哪怕只是極小塊的皮膚組織，通過細胞增殖后，都可以做無數(shù)次的實驗?！?/p>

　　摸清犬的發(fā)情排卵規(guī)律，團隊拿到了它的成熟卵母細胞，然后進行克隆胚胎的構(gòu)建。其過程是，先去掉卵母細胞的細胞核，“遺傳物質(zhì)都在細胞核中”，而后“蘋果”的體細胞從液氮中復蘇，經(jīng)電融合，將其細胞核轉(zhuǎn)入去核的卵母細胞，再激活重構(gòu)的卵母細胞，克隆胚胎即構(gòu)建完備。下一步就是把克隆胚胎移植到代孕的子宮，30天后，給狗做B超，檢測顯示，“代孕媽媽”懷孕了。又過一個月，2017年5月28日，世界首例基因敲除體細胞克隆犬“龍龍”誕生。

　　前后進行了100多次實驗

　　最終攻克電融合等系列難題

　　犬不同于小鼠、牛、羊等生物，它很特殊，一直以來被認作是世界上最難被克隆的動物之一。2005年，世界首例體細胞克隆犬“史努比”在韓國誕生。此后，犬體細胞克隆技術(shù)就一直掌握在韓國人手中，從未被其他國家突破?！褒堼垺钡恼Q生，也標志著中國成為繼韓國之后第二個獨立自主掌握犬體細胞克隆技術(shù)的國家，同時，首次實現(xiàn)犬基因敲除體細胞克隆。

　　除了摸清發(fā)情規(guī)律，獲得成熟的卵母細胞外，最難的是電融合。犬卵母細胞中富含脂類物質(zhì)，顏色較深，黏性很大，顯微操作較困難，電融合的效率不高，“團隊一直交流，不斷調(diào)整參數(shù)去試，最終才成功?！蓖鯐悦裾f?！扒扒昂蠛蠊策M行了100余次實驗?！蓖鯐悦裾f，實驗最終攻克了電融合等一系列難題。“龍龍”的外觀跟“蘋果”看起來一樣，但因為“龍龍”還小，目前在動脈粥樣硬化疾病上，尚沒有明確的表型。

　　科普

　　為何克隆犬此前鮮有聞之

　　21年前，克隆羊“多莉”誕生，震動世界。而后，克隆牛、克隆豬等克隆動物，陸續(xù)誕生，但對克隆犬，此前卻鮮有聞之？克隆犬的首要難題是成熟卵母細胞的獲取?？寺“ㄈ齻€主要的技術(shù)環(huán)節(jié)，一是成熟卵母細胞的獲取及卵母細胞去核，二是克隆胚胎制備，三是克隆胚胎的移植。

　　成熟卵母細胞的獲取有兩個途徑：體外成熟培養(yǎng)和體內(nèi)輸卵管沖卵獲取。比如豬、牛、羊等動物，可以去屠宰場獲取被屠宰牲畜的卵巢，從卵巢的卵泡中取出未成熟的卵母細胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，便可用于后續(xù)的體細胞克隆。犬卵母細胞從卵泡中排出后處于G V期，是未成熟的卵子，需在輸卵管中停留48-72小時達到成熟期（MⅡ），而體外成熟培養(yǎng)效率極低，幾乎無法滿足克隆需求，因此只能通過體內(nèi)成熟的方法，獲取體內(nèi)成熟卵子，用于犬的體細胞克隆。

　　犬的發(fā)情周期長達幾個月，發(fā)情期持續(xù)10-15天，但排卵后從卵母細胞成熟到老化的間隔時間較短。因此，獲取成熟且質(zhì)量好的卵母細胞窗口期非常短。這就要求準確判斷犬的排卵及卵子成熟的時間，才能獲得處于理想狀態(tài)的卵子用于克隆胚胎的制備。而一旦錯過卵子成熟的時間，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗平均排卵7-8枚，“取得早沒成熟，過晚又老化了。甚至同一批卵母細胞，有的成熟早，有的晚?！?/p>

　　釋疑

　　克隆犬可以用來做什么？

　　王曉民說，目前在韓國，克隆犬有多種用途，首先是克隆優(yōu)良工作犬，如搜救犬，緝毒犬，導盲犬等，“這些犬有些特殊的技能，跟遺傳因素影響比較大，而訓練起來又非常難?！睋?jù)報道顯示，9·11事件中的“英雄”搜救犬，就曾被克隆出來?？寺∫灿脕肀Ｗo瀕危犬科動物，如紅狼，草原胡狼，灰狼等。建立疾病模型后，再“復制粘貼”，克隆技術(shù)還能夠制造更多的疾病模型犬，用于人類疾病的研究。

　　此外，犬是非常理想和成熟的實驗動物，與人類在營養(yǎng)代謝、生理解剖等方面有很多相似點，而且狗溫順，配合度高，“比豬、猴子等動物都更聽話?！辟嚵紝W說，目前團隊在帕金森、自閉癥、糖尿病等方面都有研究，如果有需要，也可以建立狗疾病模型，進行藥物篩選。王曉民說，目前國內(nèi)克隆動物主要用于科學研究，包括疾病模型、藥物研發(fā)、瀕危物種保存等。賴良學說，在“龍龍”出生后，不少警犬基地就打來電話，希望進行合作。警犬珍貴，進口又較貴，團隊后續(xù)也希望通過將基因編輯技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合，批量培育嗅覺、奔跑能力更強的警犬。

　　“復制版”寵物狗會保留原來的記憶嗎？

　　對愛養(yǎng)寵物的人來說，最值得期待的就是克隆寵物犬了。有報道顯示，韓國有公司推出寵物克隆服務，每只克隆小狗的價值約為10萬美元，價格不菲?！皠游矬w細胞克隆研究相對較寬松，而人體細胞克隆研究是嚴格禁止的，包括早期體細胞克隆胚胎等。”王曉民說。

　　克隆狗還留有原來的記憶嗎？性格愛好是否一致？王曉民說，克隆犬從基因?qū)用鎭碚f，和它的原始版本并無二致，但它的成長仍有后天因素的影響，性格、愛好、記憶，這些因素不可遺傳，被克隆狗的記憶只屬于自己，克隆狗也會有只屬于自己的記憶。王曉民查閱資料發(fā)現(xiàn)，韓國方面有對克隆狗的健康狀況做過研究，包括克隆狗的體重、體形、顱骨尺寸、骨板、血常規(guī)等的檢測，與正常狗相比沒有差別。克隆的狗都很健康，沒有出現(xiàn)一些重大疾病，壽命與正常狗也相一致。

　　花絮

　　在增城一個狗場待一年

　　掌握狗狗排卵“寶典”

　　2012年因國家科技重大專項項目———“實驗用beagle犬及疾病模型犬研究開發(fā)平臺”的需要，廣州醫(yī)藥研究總院有限公司聯(lián)合南京大學模式動物研究所及中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院共同從事犬疾病模型的研究。

　　從那時起，王曉民就成了狗場的“常駐民”。他待在廣州醫(yī)藥研究總院有限公司設(shè)立在增城的一個狗場，每天和成百上千只狗朝夕相處，觀察它們。彼時，他剛讀完研究生，對狗這種動物的生殖生理特性并無太多了解。之所以要和狗相伴，是因為這個平臺最初的想法就是通過克隆的方法構(gòu)建疾病模型犬。

　　在不確定性中找規(guī)律，是賴良學團隊首先要突破的。此時，團隊唯一的資源就是韓國人發(fā)表的文章，但因為沒有具體細節(jié)，一切都是從零開始。王曉民記得，第一次做狗的“外科手術(shù)”，嘗試給狗取卵時，錯將子宮當成了輸卵管，還鬧了笑話。

　　實驗需要大量的樣本，狗的發(fā)情時間持續(xù)10-15天，王曉民從幾百只狗中，挑選處于同一發(fā)情階段的狗，聚集在一起，集中觀察，每天監(jiān)控。他也嘗試用各種方法去記錄排卵時間。比如，通過血清測定孕激素判斷發(fā)情時間，但每只狗可能都不一樣，他嘗試搭配別的方法一起判定。在與狗狗相伴的一年時間里，王曉民終于掌握了一套自己的“寶典”，“測孕酮值、觀察細胞圖片、用公狗去試情，這三種方法配合使用。”

　　克隆狗誕生

　　“蘋果”出生后，從其耳朵上取下極小塊的皮膚組織，通過細胞體外培養(yǎng)，保存在液氮罐中。

　　摸清犬的發(fā)情排卵規(guī)律，團隊拿到它的成熟卵母細胞。

　　先去掉卵母細胞的細胞核，“遺傳物質(zhì)都在細胞核中”。

　　之后“蘋果”的體細胞從液氮中復蘇，經(jīng)電融合，將其細胞核轉(zhuǎn)入去核的卵母細胞。

　　再激活重構(gòu)的卵母細胞，克隆胚胎即構(gòu)建完備。

　　把克隆胚胎移植到代孕的子宮。

　　30天后，給狗做B超，檢測顯示，“代孕媽媽”懷孕了。

　　又過一個月，“龍龍”就降生了，克隆狗由此誕生。

　　出品：南方都市報科學新聞工作室 主持：陳養(yǎng)凱

　　采寫：南都記者陽廣霞 實習生侯雅欣 通訊員黃博純