生命作為自然最美的杰作,其誕生過(guò)程令人著迷。在早期胚胎發(fā)育階段,受精卵通過(guò)細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化形成囊胚;囊胚在子宮著床后經(jīng)過(guò)原腸運(yùn)動(dòng)(Gastrulation)形成外、中、內(nèi)三個(gè)胚層。外胚層將發(fā)育成機(jī)體的神經(jīng)、皮膚等組織,中胚層將發(fā)育成心臟、血液、肌肉和骨骼等組織,而內(nèi)胚層則發(fā)育成肺、肝、胰腺和腸等內(nèi)臟器官。因此,外、中、內(nèi)三胚層的形成過(guò)程對(duì)于胚胎發(fā)育的正常進(jìn)行十分重要,并影響胎兒是否能夠順利從母體誕生。正如英國(guó)著名發(fā)育生物學(xué)家Lewis Wolpert所說(shuō):“人生最重要的階段不是出生和結(jié)婚,甚至不是死亡,而是原腸運(yùn)動(dòng)?！痹c運(yùn)動(dòng)在進(jìn)化上非常保守,其機(jī)制受到精細(xì)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)控,是最為引人入勝的發(fā)育生物學(xué)過(guò)程。

　　通過(guò)經(jīng)典的細(xì)胞標(biāo)記移植和譜系追蹤等方法,發(fā)育生物學(xué)家在上世紀(jì)八九十年代已經(jīng)初步建立了小鼠胚胎的細(xì)胞命運(yùn)圖譜。這些研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的空間位置對(duì)于細(xì)胞命運(yùn)具有重要的影響。例如,各胚層的前體細(xì)胞在原腸胚形成之前的上胚層中具有特定的空間區(qū)域,而當(dāng)原腸運(yùn)動(dòng)完成后,前端外胚層細(xì)胞將按照頭尾(Cranio-caudal)的次序,發(fā)育為大腦及脊髓等具有嚴(yán)謹(jǐn)前后次序的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而小鼠早期胚胎發(fā)育、特別是原腸運(yùn)動(dòng)時(shí)期的胚層譜系建立及細(xì)胞命運(yùn)決定的分子機(jī)制尚不清晰,亟需從時(shí)間和空間尺度,在全基因組層面闡釋其調(diào)控關(guān)系。

　　隨著單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展,傳統(tǒng)上快速動(dòng)態(tài)變化的胚胎發(fā)育過(guò)程,獲得了類似于分子顯微鏡一樣的利器。借助單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,多篇針對(duì)原腸運(yùn)動(dòng)期間細(xì)胞命運(yùn)決定的工作陸續(xù)在Nature雜志上發(fā)表,形成研究熱點(diǎn)。例如John C. Marioni和Berthold Gottgens實(shí)驗(yàn)室合作,構(gòu)建了小鼠原腸運(yùn)動(dòng)(E6.5)到器官發(fā)生早期階段(E8.5)的細(xì)胞命運(yùn)變化路徑(Pijuan-Sala et al., 2019);同時(shí)發(fā)表的另一項(xiàng)工作(Cao et al., 2019)研究了小鼠器官發(fā)生階段(E9.5-E13.5)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組情況,鑒定出56種胚胎細(xì)胞的發(fā)育軌跡;隨后Anna-Katerina Hadjantonakis和Dana Pe’er實(shí)驗(yàn)室共同在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組水平上解析了內(nèi)胚層細(xì)胞的發(fā)育路徑(Nowotschin et al., 2019);Chan等結(jié)合基因編輯技術(shù)進(jìn)行譜系示蹤,揭示了原腸運(yùn)動(dòng)期間的譜系轉(zhuǎn)換,證實(shí)內(nèi)胚層具有兩重起源,分別來(lái)自胚外部分和胚胎部分(Chan et al., 2019)。

　　雖然單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析可以重建胚胎細(xì)胞的發(fā)育軌跡,但缺乏真實(shí)的空間信息,無(wú)法將發(fā)育調(diào)控過(guò)程中的時(shí)間和空間信息聯(lián)合分析,而細(xì)胞在早期胚胎中的空間位置對(duì)其發(fā)育分化命運(yùn)又是至關(guān)重要的。為解決這一難題,景乃禾課題組及其合作團(tuán)隊(duì)多年來(lái)在這一領(lǐng)域深耕,建立了一種基于激光顯微切割的低起始量空間轉(zhuǎn)錄組分析方法(Geo-seq)(Chen et al., 2017),并首先完成了原腸運(yùn)動(dòng)中期外胚層的三維空間分子圖譜(Peng et al., 2016)，進(jìn)一步利用該技術(shù)對(duì)小鼠早期胚胎發(fā)育多個(gè)時(shí)期(E5.5、E6.0、E6.5、E7.0和E7.5)的外、中、內(nèi)三個(gè)胚層構(gòu)建空間轉(zhuǎn)錄組,建立起百科全書(shū)式全基因組的時(shí)空表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://egastrulation.sibcb.ac.cn/)。此數(shù)據(jù)庫(kù)實(shí)現(xiàn)了小鼠早期胚胎所有表達(dá)基因高分辨率的數(shù)字化原位雜交圖譜,可供其他研究者查詢和分析基因的三維表達(dá)模式、共表達(dá)關(guān)系以及根據(jù)特征表達(dá)模式檢索基因等。這是目前國(guó)際上關(guān)于小鼠原腸運(yùn)動(dòng)時(shí)期最全面、最完整的交互性時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。

　　  圖1. Geo-seq樣品收集示意圖和二維數(shù)據(jù)可視化(corn-plot)

　　Geo-seq收取E5.5-E7.5五個(gè)時(shí)期的上胚層/外胚層和內(nèi)胚層,收取E7.0和E7.5時(shí)期的中胚層。根據(jù)胚胎大小和胚胎結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度,分不同區(qū)域收取。對(duì)三維空間轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)進(jìn)行平面化展示,構(gòu)建corn-plot。紅色代表高表達(dá),不同的點(diǎn)代表不同的樣品。

　　為揭示不同時(shí)期、不同空間位置的胚胎細(xì)胞在胚層譜系上的聯(lián)系,研究人員借鑒更具生物學(xué)意義、更加穩(wěn)健的SCENIC數(shù)據(jù)分析方法(Aibar et al., 2017),結(jié)合著床前胚胎的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),將發(fā)育過(guò)程中最重要的時(shí)間和空間信息聯(lián)合分析,構(gòu)建了小鼠早期胚胎發(fā)育過(guò)程的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),并從分子層面重構(gòu)了胚層譜系的發(fā)生過(guò)程。發(fā)育生物學(xué)的傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,內(nèi)胚層主要由原腸運(yùn)動(dòng)過(guò)程中原條遷移出來(lái)的細(xì)胞構(gòu)成。而這一研究的最新發(fā)現(xiàn)是,內(nèi)胚層細(xì)胞可能很早就發(fā)生細(xì)胞命運(yùn)特化,三胚層譜系建成時(shí)的內(nèi)胚層與原始內(nèi)胚層之間存在更緊密的聯(lián)系。同時(shí)發(fā)現(xiàn),部分外胚層和中胚層具有共同的前體細(xì)胞。這將指導(dǎo)發(fā)育生物學(xué)研究人員進(jìn)一步通過(guò)譜系追蹤等遺傳學(xué)方法,研究胚層譜系建立和細(xì)胞命運(yùn)決定,促進(jìn)干細(xì)胞生物學(xué)研究人員對(duì)神經(jīng)外胚層多能干細(xì)胞的研究,完善體外肝細(xì)胞、胰島B細(xì)胞和脊髓神經(jīng)細(xì)胞等器官前體細(xì)胞的分化體系,推動(dòng)細(xì)胞治療和藥物篩選工作的發(fā)展。

　　 圖2. E2.5時(shí)期到E7.5時(shí)期的空間結(jié)構(gòu)域相似性

　　不同時(shí)期的顏色條代表基因表達(dá)結(jié)構(gòu)域,MOR-桑椹胚,ICM-內(nèi)細(xì)胞團(tuán),Epi-上胚層,PrE-原始內(nèi)胚層,En-內(nèi)胚層,E1-內(nèi)胚層基因表達(dá)結(jié)構(gòu)域1,Ect-外胚層,PS-原條,M-中胚層,MA-前端中胚層,MP-后端中胚層。計(jì)算結(jié)構(gòu)域之間的相關(guān)性,連接線的粗細(xì)表示相對(duì)相關(guān)性大小。

　　為了探索胚層譜系建立過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)分子,研究者進(jìn)行了信號(hào)通路富集分析。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn),首次發(fā)現(xiàn)Hippo/Yap信號(hào)通路在內(nèi)胚層譜系發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。同時(shí)也找到了許多在胚層譜系發(fā)生過(guò)程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。這項(xiàng)工作系統(tǒng)全面地繪制了早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,譜系建立的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),這將大大推動(dòng)發(fā)育生物學(xué)和干細(xì)胞生物學(xué)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)抉擇的認(rèn)識(shí),加深對(duì)生命運(yùn)行機(jī)制的理解。

　　 圖3. 胚層關(guān)鍵信號(hào)作用區(qū)域及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

　　繪制了小鼠胚胎E5.5-E7.5時(shí)期外、中、內(nèi)三胚層的關(guān)鍵信號(hào)通路作用區(qū)域;不同顏色代表不同組的轉(zhuǎn)錄因子;棕色連接線代表正相關(guān),綠色連接線代表負(fù)相關(guān),連接線的粗細(xì)代表相關(guān)程度;MGI數(shù)據(jù)庫(kù)中敲除小鼠表型與原腸運(yùn)動(dòng)異常的標(biāo)注為三角符號(hào)。

　　本研究主要由中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心/生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所景乃禾課題組、中國(guó)科學(xué)院-馬普學(xué)會(huì)計(jì)算生物學(xué)伙伴研究所韓敬東課題組與中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦課題組共同合作完成,中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦研究員、中科院馬普計(jì)算生物研究所索生寶博士、生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的崔桂忠博士和禹方博士為該論文的共同第一作者,景乃禾研究員、韓敬東研究員和彭廣敦研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員、悉尼大學(xué)Patrick P.L. Tam教授、生化與細(xì)胞所化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、高性能計(jì)算存儲(chǔ)與網(wǎng)絡(luò)服務(wù)平臺(tái)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的大力支持。這項(xiàng)工作得到了中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、廣東省科學(xué)技術(shù)基金、廣州再生醫(yī)學(xué)與健康廣東省實(shí)驗(yàn)室前沿探索項(xiàng)目、上海市自然科學(xué)基金和上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的資助。

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