發(fā)布時間：2011-10-10
1.多能性細胞的研究歷史
人類是地球上最好奇的一種動物，當?shù)谝粋€孩子對著自己掉下的牙齒發(fā)呆，琢磨為什么玫瑰花可以長出新枝而自己的牙齒埋進土里卻什么也長不出來開始，人類就已經(jīng)走上了探索多能性之路了。
我們都知道，一個人的個體發(fā)育是由受精卵開始的。由媽媽那里來的卵子和從爸爸那里來的精子結(jié)合后，形成一個受精卵，專業(yè)上講就是合子。受精卵一分二、二分四，以幾何級數(shù)倍增，并且不斷的分化、遷移，最終形成一個新的個體。
胚胎發(fā)育從受精卵開始，經(jīng)歷2細胞、4細胞、8細胞、16細胞、桑椹胚、囊胚和孵化胚等階段，隨后發(fā)生附植，經(jīng)原腸化作用形成3個胚層?；旧现v，凡是取自早于囊胚期內(nèi)細胞團之前的胚胎的干細胞以及與它們結(jié)構、性質(zhì)、功能一樣的細胞我們都稱它們?yōu)榕咛ジ杉毎?。胚胎干細胞是研究多能性的最理想的材料，因為它們是除了受精卵以外分化能力最強的一類細胞。事實上，除了胎盤以外，嚴格意義上的胚胎干細胞可以分化成動物體（實際上是小鼠）的所有種類的細胞、組織和器官。
對于多能性的研究是一個很長的故事，現(xiàn)在讓我們從頭說起。
·不是胚胎干細胞的胚胎干細胞——胚胎癌細胞
人類是那么想知道多能性的秘密，以至于早在19世紀，就有人提出來通過研究胚胎癌細胞來探索多能性的秘密。
為什么呢？因為胚胎實在是太小、太難得了，如果你要研究胚胎干細胞的話，必需得到非常早期的細胞，而這樣的細胞是很難從組織里分離出來的，就算分離出來也很難讓它們在人工的條件下生存下來，更不要說保持它們的自我更新和分化的能力了。
所以，在很早以前就有人把主意打到了胚胎癌細胞的頭上。胚胎癌細胞是一類發(fā)生于原始生殖細胞的未分化癌，由于它的特殊的生物學特點，人們認為它的形成在一定程度上反映了胚胎的發(fā)育，而胚胎癌細胞可能與胚胎早期未分化的干細胞相類似。但是這種腫瘤在人或動物體內(nèi)的發(fā)病率是非常低的，這限制了胚胎癌細胞的研究，使得早期的動物多能性的研究舉步維艱。
早在1956年巴里·皮爾斯和他的同事們就分離出來了人的胚胎癌細胞系，但是不幸的是他們所建立的細胞系以及此后其他科學家建立的人的胚胎癌的細胞系都沒有繼續(xù)分化的能力。
但是科學家們是不會輕易被困難打敗的，1958年，勒羅伊·史蒂文斯和他的同事們把小鼠早期胚胎移植到129品系小鼠的卵巢或腎臟被膜下，從而得到胚胎癌細胞。這是第一株被證明有類似于干細胞功能的腫瘤細胞。1964年克蘭斯密斯和皮爾斯又證明單個的胚胎癌細胞具有自我更新和多向分化的功能。至此，人類終于有了可供研究多能性的細胞系，雖然其實這不是真正意義上的胚胎干細胞，而更像是一種腫瘤干細胞。
·生殖系干細胞
另外還有一類多能性干細胞叫做生殖系干細胞，其實分為兩類，其中一類也來源于胚胎，但不是來源于嚴格意義上的胚胎干細胞的產(chǎn)生時期――內(nèi)細胞團，而是來源于之后的原始生殖嵴。這種細胞是選取在胚胎發(fā)育過程中的將要發(fā)育成生殖器官的那一部分組織加以分離得到的：以小鼠為例，胚胎干細胞應該是來源于受精后2-3天的胚胎，而生殖系干細胞則來源于8.5天到10天的胚胎；相對于人體而言則是5-10周的早期胚胎。這種細胞被稱為原始生殖細胞。
剛分離出來的原始生殖細胞只能維持很短的一段時間，但由它建立起來的胚胎生殖細胞系則具有與胚胎干細胞相似的生物學特性，比如都具有自我更新能力，都可以分化成三個胚層的細胞，都有完整的二倍體染色體等等胚胎干細胞的特點。但是，原始生殖細胞還有它自己的特點，比如，它非常的嬌嫩，普通的小鼠的胚胎干細胞即可以在支持細胞（滋養(yǎng)層細胞）中生長，也可以不要支持細胞生長，但原始生殖細胞卻不能沒有支持細胞來給它做“保姆”；更重要的是，它在印跡基因上與胚胎干細胞有著明顯的區(qū)別，以小鼠為例，9.5天的表達與體細胞一樣的印跡基因，到了10.5天就成了生殖細胞的印跡基因表達模式。這是為什么呢？研究其中的機制對我們了解胚胎發(fā)育的過程至關重要。
我們?yōu)槭裁匆芯可诚蹈杉毎?？首先，多?shù)生殖系干細胞都有著與胚胎干細胞類似的多能性，是研究多能性的較為理想的材料。但更重要的是，我們知道，幾乎所有的胚胎都是從受精卵開始的，而受精卵的形成是需要來自父母雙方的生殖細胞的，那么生殖細胞是如何結(jié)合而形成受精卵，繼而形成胚胎的？生殖細胞無疑是研究這一過程的重要一步。還有，生殖系干細胞還可以被用來研究不育不孕癥，為千千萬萬沒有孩子的家庭造福。
小故事：
原始生殖細胞是由田納西范德比爾特大學醫(yī)學院的松井泰久和馬里蘭州的詹姆斯·雷斯尼克在1992年同時分別分離得到的。
有趣的是，這種同一種類型的細胞在兩個不同的實驗室在同一時間分別得到的現(xiàn)象在細胞生物學界比比皆是，比如小鼠的胚胎干細胞、人的胚胎干細胞以及人的誘導多能性干細胞等，發(fā)現(xiàn)原始生殖細胞的這兩個實驗室就分別是在1992年的9月和10月發(fā)表的文章。不知道這是歷史的必然還是純粹的巧合。
·胚胎干細胞
(1）小鼠
真正意義上的哺乳動物的胚胎干細胞其實是從小鼠的胚胎干細胞開始的。1981年7月9日，著名的《自然》雜志發(fā)表了英國劍橋大學的馬丁·約翰·伊文思爵士和他的同事馬修·庫夫曼的一篇文章，報道他們建立的第一株小鼠的胚胎干細胞系。同年12月，美國加州大學的蓋爾·馬丁也在《美國科學院院報》上發(fā)表文章，報道了她所建立的小鼠胚胎干細胞系。
胚胎干細胞系的分離和建立是非常非常困難的。首先，小鼠的早期胚胎非常的小，事實上小鼠的子宮和卵巢在肉眼下基本上是看不到的，我們只能在放大鏡（體視鏡）下尋找它們的蹤跡，然后用非常精密的手術器械剝離囊胚（一般是用專門儀器拉制的玻璃針）。一般一只小鼠會有幾到十幾個胚胎，把它們挑出來后放在專門的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，并不是每個胚胎都可以繼續(xù)分裂生長的，也有的胚胎長著長著就自發(fā)的分化了。而“免疫手術法”因為要進行免疫操作，就更為困難一點了。
但是科學家們是不會被困難嚇倒的，英國牛津大學的保羅·特薩教授甚至做了這樣的實驗：他分別用小鼠的合子（受精卵）、2細胞、4細胞、8細胞，一直到桑椹胚和囊胚階段的胚胎建立胚胎干細胞系，比較它們的成功率以及所建立的細胞系的各種特性。這得有多大的毅力和耐性才能做到啊！
事實上，早期胚胎地顯微操作是一個技術要求極高的高精度工種，在美國，一個技術精湛的顯微操作技術人員的工資比一個原子核物理教授的工資都要高，而且還供不應求，每個技術人員都是他們實驗室的“寶貝”，即使是在金融危機的時代也完全不用擔心會“下崗”。
還有值得一提的是，馬丁·約翰·伊文思爵士因為建立小鼠胚胎干細胞系、基因敲除小鼠和基因打靶上的杰出貢獻，與馬里奧·卡佩琪和奧利弗·史密斯共同分享了2007年的諾貝爾醫(yī)學與生理學獎。事實上，基因敲除和基因打靶的基礎都是小鼠胚胎干細胞系的建立，沒有胚胎干細胞系的建立，其他的基因操作根本無從談起。
馬丁·約翰·伊文思爵士
馬丁·約翰·伊文思爵士分離培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞
除了用自然孕育的小鼠胚胎分離胚胎干細胞外，其實現(xiàn)在更多的還是用核移植的方法來獲取胚胎干細胞，就是把一個來源于體細胞的核取出來，移植進入一個小鼠的卵細胞中，經(jīng)過體外培養(yǎng)和刺激，使其分裂發(fā)育成早期胚胎,再分離培養(yǎng)成為胚胎干細胞。這種方法比直接使用胚胎更為簡單，成功率也高，更重要的是沒有倫理道德爭論，除了可以用在動物上，也可以用于人的胚胎干細胞的分離。
[延伸閱讀] 女兒國是神話嗎？
“孤雌生殖”，就是把雌性小鼠的卵母細胞拿出來經(jīng)過各種不同的物理的、化學的刺激，使其激活，形成二倍的雌原核，繼而發(fā)育成胚胎，而從這樣的胚胎中也可以分離出來胚胎干細胞。而如果這樣的胚胎繼續(xù)發(fā)育下去，就會形成“沒有父親的小鼠”了。你看，女兒國并不是只在神話傳說中才有的。
（2）人
人的胚胎干細胞的建立要晚得多。1998年11月6日的《科學》雜志發(fā)表了一篇名為“人類胚泡來源的胚胎干細胞系”的文章，介紹了第一株人類胚胎干細胞系的分離、培養(yǎng)和鑒定過程。這個工作是美國威斯康星大學的詹姆斯·亞歷山大·湯姆森教授和他的同事們的研究成果，也是胚胎干細胞研究中劃時代的一件大事。
詹姆斯·亞歷山大·湯姆森是胚胎干細胞研究領域的大牛，在2007年也是他的實驗室，與日本山中申彌的實驗室同時得到了人類誘導多能性干細胞，這也是干細胞領域劃時代性質(zhì)的一件大事，2008年，他與山中申彌共同被美國《時代》雜志評選為影響世界的100位名人的第54位。不知道他會不會是下一位諾貝爾醫(yī)學與生理學獎的獲得者，讓我們拭目以待。
詹姆斯·亞歷山大·湯姆森教授
詹姆斯·亞歷山大·湯姆森教授分離培養(yǎng)的人胚胎干細胞
湯姆森他們使用的是由捐獻者在體外人工受精的受精卵（這些受精卵應該是做試管嬰兒時廢棄剩下的材料，由患者授權捐出），他們一共選取了36個冷凍或未經(jīng)冷凍的受精卵，其中20個在特殊的培養(yǎng)基中發(fā)育成了胚泡。他們選取了其中的14個分離胚泡中的內(nèi)細胞團，其中5個最終形成了胚胎干細胞系。
他們?yōu)樽约旱娜祟惻咛ジ杉毎抵贫藝栏竦亩x：（1）必需來源于著床前或正在著床的早期胚胎；（2）可以長期增殖而不分化；（3）具有穩(wěn)定的可以分化成三個胚層的能力。在他們的文章中，這些目的都達到了。
到目前為止，他們所分離得到的人類胚胎干細胞系在世界各地的實驗室中得到了廣泛的應用，是最經(jīng)典的人類胚胎干細胞系。套句“大腕”里的話：如果一個研究人類胚胎干細胞的實驗室如果用的不是來自于湯姆森實驗室的H1或H9等細胞系，你簡直就不好意思和人打招呼！
事實上，湯姆森實驗室的胚胎干細胞研究是有著非常深厚的科研基礎的，在人類胚胎干細胞之前，他們就分別在1995年和1996年首次分離鑒定了恒河猴和狨猴的胚胎干細胞，同時做了大量的胚胎干細胞自我更新及多能性機制方面的研究，所以由他們實驗室首次分離鑒定出人類胚胎干細胞和人類誘導多能性干細胞一點兒也不奇怪。
·成長的故事——人與小鼠的胚胎干細胞的不同
到目前為止，研究最多的，還是人與小鼠的胚胎干細胞，但是實際上這兩種干細胞還是有很大的區(qū)別的，這些區(qū)別在干細胞學界引起了巨大的曠日持久的爭議，到目前為止還無法得出一個定論。
從經(jīng)典的定義上來講，胚胎干細胞必需是來自于囊胚期的內(nèi)細胞團的細胞，但是人們發(fā)現(xiàn)這些細胞并不都是一致的，而是多種細胞的混合體。那么，我們很容易就可以想得到，從這些細胞出發(fā)，我們得到的它們的后代也不會是完全相同的，有的也許更幼稚一點，有的也許更成熟一點。
事實上也確實是如此，一個細胞系的細胞也許通過一定的實驗條件的選擇，可以達到一致，但是不同批次不同品系甚至不同物種的胚胎干細胞就會有很大的差別了。
拿人和小鼠的胚胎干細胞來講吧，人的胚胎干細胞無論是在形態(tài)上還是在很多生物學特性上都更類似于小鼠的上皮胚胎干細胞，而人的生殖系干細胞卻長得很像小鼠的胚胎干細胞。因為上皮層在胚胎發(fā)育中是晚于囊胚期的，所以人們一致傾向于認為人的所謂“胚胎干細胞”實際上比小鼠的要“成熟”。為了得到更為“幼稚”的人類的胚胎干細胞，人們做了各種各樣的嘗試，但到目前為止還沒有什么得到定論的結(jié)果。畢竟，人和小鼠本來就是兩種不同的物種，究竟是怎么發(fā)育和進化的，到目前為止還是一個謎。
但，科學的目的不就是揭示世界上的謎團的嗎？
·誘導多能性干細胞
目前，胚胎干細胞研究中最熱的一個方向其實是“誘導多能性干細胞”，就像干細胞界的“超女”和“快男”一樣，2006年一炮而紅，至今粉絲眾多，短短4年，發(fā)表的文章就已經(jīng)超過2500篇，真的可以說得上是炙手可熱。在這個領域中國科學家也貢獻頗多，可以說我們是和世界上的其他科學家站在同一個起跑線上，齊頭并進。
簡單的說，動物體的胚胎發(fā)育其實是一個程序化的過程，從受精卵開始，不斷的分裂、增殖、分化，在什么時候什么位置表達什么蛋白都是設定好的，而這個設計圖就藏在我們的DNA序列之中，生而有之。做為進化樹上較為高等的哺乳動物，這個程序化的過程大部分是不可逆的，所以才有所謂的終末分化細胞。
但是，人們?yōu)榱搜芯慷嗄苄缘拿孛?，總是在想方設法地想要逆轉(zhuǎn)這個過程。最初人們想出的辦法就是核移植，把一個體細胞的核移入到一個去核的卵細胞中，讓這個卵細胞分裂增殖，這就意味著重新啟動了那個體細胞的發(fā)育程序，從而得到一個新個體，綿羊“多莉”就是這樣來的。
但這并不能完全說明問題，因為我們只是拿一個細胞的一部分逆回到了原始的狀態(tài)，而且還是通過把它和原始細胞融合才能得到。所以不能就此滿足的科學家繼續(xù)探索，終于在2006年日本的帥哥科學家山中申彌第一個做出了小鼠的誘導多能性干細胞，第二年又和美國的一個實驗室同時做出了人的誘導多能性干細胞。
這種細胞就是通過實驗室人工誘導的方法（最初是用病毒轉(zhuǎn)基因的方法）來使已經(jīng)終末分化的細胞重編程成為最為“幼稚”的胚胎干細胞。不需要卵細胞，只需要一些病毒、質(zhì)粒和化合物，就可以把一個體細胞恢復成具有胚胎干細胞特性的細胞。神奇吧？
關于誘導多能性干細胞的具體研究我們將會在后面的章節(jié)進行專門的論述。
2.為什么要研究胚胎干細胞
·胚胎干細胞在再生醫(yī)學中的重要作用
相對于目前已經(jīng)大量用于臨床的成體干細胞來講，胚胎干細胞從長遠來講，在再生醫(yī)學中具有更輝煌的前景。
這是由胚胎干細胞的兩個特點決定的：首先，胚胎干細胞具有強大的自我更新和無限增殖的能力，這樣就可以源源不斷的提供用于修復的細胞；其次，胚胎干細胞還有強大的分化能力，理論上講，嚴格意義上的胚胎干細胞可以分化成除了胎盤組織以外的人體所有種類的細胞，也就是說我們想要什么細胞它就能變成什么細胞。
強大吧？我們前面講到的那么多的成體干細胞和它一比，就都成了“小菜一碟”了。事實上，胚胎干細胞可變成各種各樣的成體干細胞，再分化成我們要的細胞。
所以，做為種子細胞，胚胎干細胞將是再生醫(yī)學的終極種子，現(xiàn)在所用的各種成體干細胞的療法最終都將讓位于胚胎干細胞。
·從胚胎發(fā)育到終極問題
“我是誰？我從哪里來？我又要到哪里去？”
這大概是每個人在成長過程中都會問自己的一個問題，這也是我們?nèi)祟惖囊粋€終極問題。從笛卡爾的“我思故我在”到現(xiàn)代神經(jīng)遺傳學、進化心理學理論，人類一直在這個問題上不停地追問、不停地探討。而研究胚胎的發(fā)育正是解決這個問題的一個關鍵。
讀過生物的人都知道，每個胚胎發(fā)育的過程實際上也是一個生物進化的小規(guī)模重演，這是為什么呢？理論很多，但基本比較得到共識的看法是：生物的胚胎發(fā)育，是一個基因調(diào)控的過程，不同的基因依次被打開、關閉。由于這是一個信號一級一級地放大的過程，越早表達的基因，其后來的影響將會被越放越大。因此能夠保留的突變一般發(fā)生在胚胎發(fā)育的晚期，因為如果突變發(fā)生在發(fā)育的早期，將會對后面的發(fā)育過程發(fā)生重大的影響，其結(jié)果往往是災難性的。這樣，那些較早表達的基因，往往是在進化史上較為古老的祖先基因，較晚表達的基因，則是后來逐漸加入的。因此胚胎發(fā)育的過程就是一個從祖先基因到新近基因的依次表達的過程，所以可以在此過程中重演進化過程的某些特征。
所以對胚胎發(fā)育的研究也是對進化過程的一種研究，正是解決我們從哪里來的這個終極問題的一個方面。我們可以通過研究早期胚胎哪些基因在何時打開何時關閉，來推測它們在生物體中的作用，乃至在整個生物進化中的作用，從而勾畫出生物進化的全景。
還有，“我”是從哪里來的呢？“自我意識”是如何產(chǎn)生的呢？這是神經(jīng)發(fā)育學要解決的一個問題?，F(xiàn)在人們已經(jīng)知道，人類早在胚胎期就已經(jīng)有了意識，那么這些意識是從何時，從哪些細胞中開始產(chǎn)生的呢？“我”到底是如何認識到“我”的呢？這就要在胚胎的發(fā)育中尋找答案。但是我們總不能刨開媽媽的肚子研究里面的胚胎吧？所以從胚胎干細胞開始研究胚胎早期發(fā)育也是神經(jīng)發(fā)育學的主要手段。
最后，通過研究胚胎干細胞來研究胚胎的早期發(fā)育，還有一個非常接近與實用的目的，就是改善人類的生殖。我們知道，大部分的流產(chǎn)實際上都發(fā)生在懷孕早期，而發(fā)生流產(chǎn)的原因多數(shù)都是胚胎發(fā)育出現(xiàn)了錯誤造成的。實際上很多畸形、遺傳性疾病也都是在胚胎發(fā)育的早期就開始了，所以對胚胎干細胞的研究可以在根本上了解這些錯誤是如何造成的，最終避免在生育過程中發(fā)生這些錯誤，以達到優(yōu)生優(yōu)育的目的，并為廣大不孕不育癥患者帶來福音，還給他們一個幸福的家庭。
·藥物篩選和基因操作
胚胎干細胞也是研究人類疾病的良好模型。
一般研究一個疾病，最好就是可以有一個相應的動物模型，比如胰島素的發(fā)明就得益于建立了狗的糖尿病模型。但對于大多數(shù)的人類疾病而言，人們都尚未建立相應的動物模型。還有一些疾病，如艾滋病、丙型肝炎等，致病的病毒只能感染人和黑猩猩，大大的限制了對這些疾病的研究。而胚胎干細胞因為可以分化成體內(nèi)的各種細胞，我們就可以根據(jù)各種疾病發(fā)生的不同機制用胚胎干細胞來建立相應的疾病模型，從而研究疾病的發(fā)生、發(fā)展、并最終找到適宜的治療方案。
比如，我們可以把建立某個疾病特異性的胚胎干細胞系，然后讓它在體外向我們需要的方向分化，在分化的過程中觀察和檢測它的各種基因的表達與調(diào)控，對照正常的胚胎干細胞系的分化過程，我們就可以從中研究這個疾病發(fā)生的機制。
如果同時我們用不同的藥物來處理這些細胞，我們就可以找出哪些藥物可以調(diào)控這些病理機制，然后找出可以用于治療這種疾病的候選藥物。因為胚胎干細胞可以在體外無無限增殖，所以我們可用的細胞資源也是無限的，而細胞操作又相對比較容易，現(xiàn)代藥物篩選已經(jīng)可以做到大批量、規(guī)?；膾呙瑁淮尉涂梢院Y選成百上千個化合物。這種高通量的藥物篩選正是當今藥物開發(fā)的一個主流，在我們國家也正在如火如荼的開展，正是高科技、集約化經(jīng)濟的朝陽產(chǎn)業(yè)，必將在未來帶動新興科技產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
光是在細胞水平來進行疾病的研究和藥物的篩選還是不夠的，最終我們還是要做到個體水平。這樣，基因敲除和基因打靶就登場了。
這兩個技術就是前面講到的與小鼠胚胎干細胞的發(fā)現(xiàn)一起，獲得2007年諾貝爾獎的研究成果。其中，小鼠胚胎干細胞系的獲得是它們的基礎，因為所有的基因操作都是在胚胎干細胞的基礎上進行的。
當然，其中還有另一個很重要的發(fā)現(xiàn)，就是基因的同源重組現(xiàn)象。同源重組就是人們發(fā)現(xiàn)在生物體中如果有一段外源的DNA在序列上與自身的DNA相同或非常相似時，就有可能發(fā)生同源重組，就是這一段外源的DNA結(jié)合到自身的DNA當中去，成為自身DNA的一段。因此，如果我們把某段基因的兩端都加上一段與自身DNA相同的DNA序列，那么從理論上講，我們就可以把這段基因整合到自身DNA中，替代掉原來存在于這個地方的那一段DNA（像不像“移花接木”大法？）。如果我們接入的這段DNA是無義的（就是沒作用的）就是基因敲除，如果我們接入的DNA是為了達到某種目的的，比如突變、回復突變等，就是基因打靶。
基因敲除和基因打靶都必須是在胚胎干細胞上進行，一是因為胚胎干細胞增殖速度快，可以無限增殖，易于進行基因操作;另一個原因是胚胎干細胞在表觀遺傳學上與受精卵的特點最為接近，利用胚胎干細胞進行的基因操作更易于得到我們所需要的動物模型。
一般我們先用胚胎干細胞進行基因操作，也就是敲除或是打靶，得到基因被改變的細胞之后，把這種細胞的細胞核取出來，移植到小鼠的受精卵中，再將受精卵植入小鼠的子宮，那么發(fā)育出的個體就是我們所需要的經(jīng)過基因改造的個體了。
現(xiàn)在基因操作的技術甚至可以做到給我們要操作的基因加一個分子開關，當我們需要它表達或不再表達時，只要加一些特定的藥物刺激，就會使這個基因關閉或打開，這樣我們就可以研究一個基因到底是在什么時候，什么位置發(fā)揮作用的，如果它在錯誤的時間、錯誤的地點表達又會發(fā)生什么事。這樣做還可以研究一些非常重要的基因，比如對生物體來說生死攸關的基因，如果一下子就把它關閉了，這個生物體也許根本就無法出生，可是我們給它加了開關后，就可以等動物出生后在關閉或半關閉，然后研究它的生物學效應。
3.如何研究胚胎干細胞
我們?nèi)绾蝸硌芯颗咛ジ杉毎兀?/FONT>
首先，是胚胎干細胞的分離與鑒定。
雖然到目前為止，我們已經(jīng)分離到了多種小鼠和人的胚胎干細胞系還有好多種物種的胚胎干細胞系，但是，在胚胎干細胞系的分類和鑒定上還有很多的工作要做。就拿小鼠來說，有的品系就很容易得到胚胎干細胞系，可有的品系就怎么也得不到，為什么呢？我們要研究其中的機制。拿人類來講，各種疾病模型的胚胎干細胞系當然也是非常有用的了。所以，尋求更為快捷、簡單、高效的分離方法一直是各國科學界努力的方向。近年來炙手可熱的誘導多能性干細胞就是這個方向上的一大突破。
分離之后就是鑒定了，前面我們已經(jīng)講過，干細胞以及胚胎干細胞都有它們自己的標志，需要通過鑒定它們來確定我們拿到的是不是真正的干細胞或胚胎干細胞。但其實因為各種胚胎干細胞在分化發(fā)育中所處的時期不同，所以其實它們之間還是有著千絲萬縷的差別的，這也給了科學家們一個打口水仗的機會，除了一些大家公認的標志以外，總會有人提出新的標志，然后就會有人提出異議或討論，吵個不亦樂乎。不過這就是科研的必經(jīng)之路，甚至是科研的樂趣之一，吵吵更健康嘛！在這些爭論中我們對胚胎干細胞理解就會一步一步的更為深入，更為接近它的真實本質(zhì)。
但無論如何，胚胎干細胞的鑒定都有一個金標準的，對于人的胚胎干細胞，因為克隆人在倫理上的不許可，所以它的金標準是可以在免疫缺陷鼠的體內(nèi)形成畸胎瘤，而這個畸胎瘤必須有發(fā)育完好的三個胚層的結(jié)構。
對于小鼠來講，則是嵌合體和四倍體小鼠的形成。（不要誤會，所謂四倍體小鼠并不是指小鼠的染色體加倍達到了四倍體，實際上出生的小鼠還是正常的二倍體，但其中會有一個四倍體的過程罷了。）
嵌合體和四倍體小鼠的形成都基于一個叫做“囊胚注射”的技術，這項技術也屬于顯微操作技術，就是把胚胎干細胞注射進入囊胚中讓其發(fā)育成成體的一種實驗手段。
如果注射入的囊胚是一個正常發(fā)育的囊胚，那注射進入的胚胎干細胞就與囊胚中已有的細胞一起發(fā)育、分化，最終形成嵌合體，也就是注射入的細胞與被注射的小鼠細胞混合形成的成體小鼠。在這種情況下，如果其中一只鼠是黑的，一只鼠是白的，那么出生的鼠就會是雜色的，毛色象奶牛一樣是斑駁的。
如果我們?nèi)∫粋€剛好分裂成為兩個細胞的受精卵，用電融合的方法使它們重新變成一個細胞再發(fā)育，那么這個細胞發(fā)育出來的囊胚就只能形成胎盤（正常的胎盤實際上也是四倍體，不過是自然形成的），這時我們再把胚胎干細胞注射進入這個囊胚，得到的胚胎就是完全由我們注入的胚胎干細胞發(fā)育而來的，而不會有受體小鼠的細胞，胚胎干細胞來源小鼠是白色的，那出生的小鼠就是白色，黑色的就會是純黑的，不會有雜色的情況出現(xiàn)。
四倍體小鼠是小鼠胚胎干細胞鑒定的終極手段，一個胚胎干細胞只要可以得到四倍體小鼠，就完全證明它是一株合格的胚胎干細胞，大家可以放心用了。
但在人體，這個辦法是不能用的，因為這實際上就是克隆人，在各國都是被禁止的。所以人類胚胎干細胞的鑒定只停留在畸胎瘤的這一步，只要能在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)得到分化完全的畸胎瘤，我們就認定這是一株合格的人胚胎干細胞了。
其次，就是研究胚胎干細胞的自我更新能力。
胚胎干細胞是如何在體外不斷增殖的同時又維持著不分化的狀態(tài)的呢？我們知道，在我們的細胞中充斥著各種各樣的蛋白，這些蛋白相互作用、相互影響，共同來完成各種各樣的生理功能。這些蛋白相互作用的過程也是一個信息傳遞的過程，我們就稱之為“信號通路”。胚胎干細胞自我更新的信號通路就是很多實驗室研究的課題。這些信號通路并不是單一的，它們之間也互相影響、相互交叉，還與調(diào)節(jié)其他生理機制的信號通路相互聯(lián)系和相互影響，共同構成一個立體的交叉網(wǎng)絡。我們就是通過研究各個不同的蛋白以及它們與其他蛋白的相互關系，來研究到底是什么在影響著胚胎干細胞的自我更新。
第三，是胚胎干細胞的定向分化。
胚胎干細胞是有著強大分化潛能的一種細胞，如果我們不用各種各樣的手段去抑制它的分化，它自己就會自發(fā)的發(fā)生分化，可是這種分化是不受控制的，分化出來的細胞也是混雜的，這是不能用于臨床治療和科學研究的。所以我們一定要研究胚胎干細胞的定向分化，讓它們只朝一個方向分化，要向神經(jīng)分化就都向神經(jīng)分化，要向心肌分化就都向心肌分化。而且在這個過程中還要提防出現(xiàn)“南郭先生”，因為有的時候胚胎干細胞分化出的細胞看上去似模似樣，和我們要的細胞很象，但實際上就是不干活――沒有功能或功能不全。所以尋找胚胎干細胞定向的有功能的分化方法，也是研究胚胎干細胞的一個重要內(nèi)容。
最后，胚胎干細胞的終極目標還是要應用于臨床。
我們研究這么多，最終的目的還是要用它來治療疾病。前面我們已經(jīng)講過，目前才開始世界上第一粒胚胎干細胞的人體移植實驗，但是因為胚胎干細胞強大的自我更新及分化能力，它必然是未來再生醫(yī)學的明日之星。如何應用胚胎干細胞治療疾病，如何規(guī)避各種風險，如何降低成本，如何提高效率，這都是擺在科學家面前的問題。這些看上去成堆的難題在以科學研究為興趣的科學家眼里就像是一大塊令人垂涎欲滴的奶油蛋糕，引人遐思，欲罷不能。
4.胚胎干細胞研究中存在的問題
·倫理問題
胚胎干細胞研究的倫理問題，一直是一個爭論的焦點。2001年8月，當時的美國總統(tǒng)布什簽署總統(tǒng)令，禁止聯(lián)邦資金用于提取胚胎干細胞及其研究，只能對當時已有的21種胚胎干細胞展開研究，致使美國的胚胎干細胞研究一度跌入低谷（不過其實世界上最好的干細胞科學家和實驗室還是云集于美國的，沒有哪個國家能夠超越）?，F(xiàn)在的美國總統(tǒng)奧巴馬則在2009年3月9日簽署總統(tǒng)令，宣布擴大聯(lián)邦資金用于胚胎干細胞的研究。但有關胚胎干細胞研究的合法性的爭論還遠未平息，甚至與政治因素糾結(jié)在一起，影響著美國大選的走勢。
胚胎干細胞研究的倫理問題涉及到了兩個基本的道德原則：一、避免或減輕人類痛苦的原則；二、尊重人類生命價值的原則。這二者的核心是應該如何看待人類胚胎的道德地位。在這一點上有著各種各樣的看法，主要有以下幾種：
1．胚胎享有神圣創(chuàng)造物的特殊道德地位。這一般是宗教界人士的看法，小布什自稱是虔誠的基督徒，所以秉持這種看法，堅決反對胚胎干細胞研究。
2．胚胎具有與人類等同的道德地位。這種觀點認為人體的發(fā)育是一個連續(xù)的生理過程，沒有絕對的分割線可以區(qū)分胚胎和成體不同的道德地位，沒有理由否定胚胎階段的人類也是人類，每一個人類個體都有享有維持軀體完整和生命延續(xù)的權利，所以破壞胚胎就等于殺人，是違反道德的。這也是小布什那來制定他的胚胎干細胞研究政策時的倫理依據(jù)。
3．胚胎具有潛在的人的道德地位。這種觀點認為，早期胚胎雖然沒有意識，沒有心理、情感和智力，但是如果發(fā)育下去就有可能獲得所有這些成體具備的特征，所以應該把胚胎看作是潛在的人，就像失去意識和行為能力的人一樣應該得到與成體相同的尊嚴和道德尊重。
4．胚胎應受到道德尊重，但不具有與人類等同的道德地位。很多胚胎干細胞研究的科學家都秉持這樣的觀點。因為受精后發(fā)育到14天前的胚胎還沒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成，沒有感知和意識，不應該看作真正的人類個體，但它們是有著發(fā)育成人類個體的潛能的細胞，所以也應該得到一定程度的道德尊重。
5．胚胎僅僅是身體的一部分，不具有獨立的道德地位。這種觀點認為胚胎在發(fā)育到獨立的個體前，僅僅是身體的一部分，就像是一個人的其他組織器官一樣，是屬于個人的財產(chǎn)，不具有獨立的道德地位，應該尊重胚胎來源的個人的財產(chǎn)權。
在這個問題上，基于每個人的種族、宗教、受教育程度以及意識形態(tài)的不同，每個人都會有自己的看法和主張，很難取得統(tǒng)一的看法，也沒有必要取得統(tǒng)一的看法。現(xiàn)代民主社會就應該是各種觀念都能和諧相處嘛。所以聰明的科學家們想到的辦法就是規(guī)避倫理問題。
最早的人類胚胎干細胞取自于被棄的人類體外受精的受精卵，它們本來是用于試管嬰兒治療不孕癥的，如果不用于胚胎干細胞研究也會被拋棄。
后來由于各種倫理上的反對以及科學家們無窮無盡的好奇心，更多進行的是核移植的方法來獲得胚胎干細胞，就是把一個成體細胞的核置換到一個卵細胞中，再讓它發(fā)育成早期胚胎，以獲取胚胎干細胞。這種方法獲得的胚胎干細胞基本上與上一種方法得到的完全一樣，但是在某些方面，特別是在表觀遺傳學上還是有所不同的，所以好奇的科學家們眼睛還是在盯著“原教旨主義”意義上的胚胎干細胞。
可是就連核移植得到的胚胎干細胞也是反對聲一片，小布什就是其中一個。所以科學家們又另辟蹊徑，日本的山中申彌首創(chuàng)以引入外源基因（也就是轉(zhuǎn)基因）的方法，使成體的終末分化細胞重新回到最初的幼稚狀態(tài)，就是現(xiàn)在最熱的研究熱點“誘導多能性干細胞”。當然，誘導多能性干細胞與“原教旨主義”意義上的胚胎干細胞還是存在著許多差異，但這實際上更激起了科學家們的好奇心，它們有哪些不同？為什么不同？什么機制導致了不同？如何消除這些不同？都是我們正在研究和將要研究的課題。
目前，世界各國對胚胎干細胞研究的管理有著不同的規(guī)定：日本、巴西、瑞士、加拿大、澳大利亞等國允許使用體外受精丟棄的受精卵獲取胚胎干細胞；中國、韓國、印度、以色列、新加坡允許治療性克隆的研究；英國是最寬松的，不但允許治療性克隆，還允許在嚴格管理和監(jiān)控下的生殖性克隆；美國則還在糾結(jié)中。
目前為止，在胚胎干細胞的倫理學上必較能得到共識的是：(1)胚胎干細胞研究有益于人類，要尊重；(2)胚胎的地位和權利也要得到尊重；(3)胚胎和卵子、精子不是商品，不能買賣，用于研究時必須遵守相關的法律法規(guī)；(4)生殖技術需要監(jiān)督和控制；(5)堅決反對克隆人。
面對迅猛發(fā)展的胚胎干細胞研究，倫理問題確實是一個亟待解決的問題，但相信聰明的人類一定會在這中間尋找到一個平衡點的。
·免疫問題
要了解胚胎干細胞的免疫問題，首先要了解的是：什么是免疫？
免疫是生物體的一種生理功能，生物體可以依靠這種功能來識別異己，破壞和排除外來物和自身產(chǎn)生的不利于自身的物質(zhì)，維持機體的生理平衡的一種功能。
它包括3方面的功能：（1）生理防御：抵御病原體及其毒性產(chǎn)物，抵御感染性疾??；（2）自身穩(wěn)定：識別和清除機體新陳代謝中產(chǎn)生的衰老和死亡的細胞，保持機體穩(wěn)定；（3）免疫監(jiān)視：識別和消滅發(fā)生突變的細胞（比如腫瘤細胞），對細胞進行自身監(jiān)視。
一句話，免疫系統(tǒng)就像軍隊和警察一樣就是一個“排除異己”的系統(tǒng)。而要進行干細胞治療、器官移植之類，就是要拿別人的東西混入到自己的身體里，還要讓它們好好地為我們工作?？墒敲庖呦到y(tǒng)可不是那么好說話的，它可不管你是來干什么的，它只知道你不是自己人，不是自己人它就要把你擋出去或者干掉。所以規(guī)避免疫排斥就是器官移植和干細胞治療的一件大事了。
最傳統(tǒng)的辦法是什么呢？是“對抗性”辦法：你要把我干掉？哼哼！老子先把你干掉！用放療、化療的辦法先把病人的免疫系統(tǒng)干掉，然后再進行移植。而且因為人類的免疫系統(tǒng)是非常強大的――“野火燒不盡，春風吹又生”，還要在以后的階段不斷地用免疫抑制劑來抑制免疫，讓軍隊和警察不能發(fā)揮作用，直至移植進入的器官、細胞完全“化敵為我”為止。
這是一個相當危險和損傷極大的過程，很多病人還沒等到“化敵為我”就因為沒有了“軍隊和警察”而死于感染了；要么就是因為“軍隊和警察”的強烈反撲，而死于“抗宿主病”，無論是死于哪一種，都是悲劇??！
除了“對抗性”的辦法外，還有什么辦法呢？其實我們前面講到過，就是用“潛伏”的辦法，間充質(zhì)干細胞就是一種免疫原性很低的干細胞，用它來做干細胞移植，引起的免疫反應會比較低，那么相應地需要用的免疫制劑就會少很多，對身體的傷害就會小很多。
相對于間充質(zhì)干細胞，胚胎干細胞是一種免疫原性更低的干細胞，所以它更好“潛伏”。但是無論如何，它還是一個外來物，要進行移植必然會引起免疫系統(tǒng)的反撲，所以如何在治療中規(guī)避免疫排斥，一直是科學家們研究的一個熱點。
一種辦法是取得病人特異性的胚胎干細胞，就是想辦法得到需要治療的病人自己的胚胎干細胞，然后再用在病人自己身上。這樣移植進入的也是“自己人”應該就不會有免疫反應了吧？但這還存在爭論，有待進一步證明。
而且病人特異性胚胎干細胞并不容易取得，以前所用的方法主要是核移植，現(xiàn)在更火的是誘導多能性干細胞，兩者都各有利弊。
另一種辦法是進行基因改造，把所有的胚胎干細胞都改頭換面，讓它們都失去免疫原性，這樣不就可以誰想用都可以了嗎？但是人類細胞上的表面抗原成千上萬，多數(shù)還具有重要的生理功能，這是一個巨大而復雜的工程；而且基因改造也不是那么容易做的，所以這個工作做的人并不多，不能算是主流。
·生物安全問題
胚胎干細胞的應用還存在著一個生物安全的問題。
首先，胚胎干細胞系是一個可以無限增殖的細胞系，這就有了成瘤性的風險。
要知道，腫瘤的發(fā)生，第一步就是細胞的無限增殖能力，其次才是轉(zhuǎn)移性和侵襲性。腫瘤之所以是腫瘤，就是因為它不受控制的無限增殖。所以胚胎干細胞的應用，首先要解決的就是成瘤性。
但在這個問題上目前還沒有什么好辦法，因為無限增殖正好也是我們要使用它的一個特點，所以最好是體外無限增殖，體內(nèi)就可控增殖，這也是胚胎干細胞學家們研究的一個方向。
其次，胚胎干細胞在體外培養(yǎng)時，無可避免的總會用到一些動物產(chǎn)品，比如胎牛血清啦什么的（不可能完全用人的血清來培養(yǎng)，成本太過于昂貴了），就算是現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出的無血清培養(yǎng)體系，其實里面還是添加了很多動物體內(nèi)的提取物。這些動物產(chǎn)品的安全性就是一個問題，如果在移植過程中有所殘留，會對人體產(chǎn)生什么樣的影響很難估計。
而且動物體內(nèi)是否會有病原物一起被帶入也是一個問題。
大家說了，實驗室那么干凈的環(huán)境還會有病原菌嗎？注意，這里提到的不是“病原菌”而是“病原物”，其實主要指的是“病毒”，有許多病毒在感染動物的時候是可以整合到動物的基因組里去的，可以隨著動物的世代傳遞而傳遞下去，有的病毒在動物體內(nèi)已經(jīng)被同化了，可是到了人體后又可能會被激活，造成人體的疾病。
另外，造成“瘋牛病”的朊病毒也是一個例子，它實際上是一種蛋白質(zhì)，但卻可以繞過消化系統(tǒng)破壞生物體的腦組織。大千世界無奇不有，誰知道還有什么類似的東東在動物體內(nèi)等著作怪呢？這讓我們怎么放心直接把接觸過動物制品的細胞注入人體呢？
當然，免疫也是一個障礙，動物制品哪怕是再微量，對人體來說也是異物，對過敏體質(zhì)的人來說就有可能是致命的。
所以，如何去除在胚胎干細胞培養(yǎng)（實際上成體干細胞也存在這個問題）的動物制品污染的問題也是干細胞應用領域的一件大事。做為生物安全的一個重要問題，各國的衛(wèi)生監(jiān)察部門都有著相應的嚴格的規(guī)章制度。但最釜底抽薪的辦法還是讓科學家們研究出不用動物制品就可以在體外大規(guī)模培養(yǎng)各種干細胞的方法。
最后，還有一個化學品污染的問題。
在胚胎干細胞的培養(yǎng)中，也無可避免的會用到很多的化學藥品，這些化學藥品對干細胞的自我更新和分化能力的維持也許是必不可少的，但一旦進入人體就有可能造成麻煩，所以在進入人體實驗之前，這些化合物的安全性研究也是必不可少的。
目前，胚胎干細胞研究日新月異，被用來提高胚胎干細胞各種功能的化合物也越來越多，對它們的安全性的檢測也是科學家們需要研究的一個方面。
總之，胚胎干細胞是再生醫(yī)學干細胞治療的明日之星，但如何安全、高效、便捷和便宜的應用，還有很長的路要走。
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